Catalyse enzymatique, inhibiteur ; autour de l'acétylcholine. Second concours, école normale supérieure 2014

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Cinétique de synthèse de l'acétylcholine.
Au sein du cerveau, l'acétylcholine est synthétisée à partir de la choline et de l'acétyl-coenzyme
A par catalyse enzymatique. L'enzyme catalysant la réaction est la choline acétyl-transférase.
Dans la suite, on note :
P, l'acétylcholine, produit de la réaction ;
E, l'enzyme choline acétyl-transférase ;
S, le substrat formé de choline et d'acétyl-coenzyme A ;
ES, le complexe enzyme/substrat.
Le mécanisme de la catalyse enzymatique est le suivant :

1.1 ES est-il un intermédiaire réactionnel ou un état de transition ? Justifier.
ES est un intermédiaire réactionnel, sa durée de vie est très courte mais il peut être observé par des méthodes physiques.
1.2 Tracer le profil énergétique de la réaction enzymatique décrite.

E T : état de transition ; CR : coordonnée réactionnelle

EA : énergie d'activation ; E : énergie de la réaction

# : intermédiaire réactionnel

(1) : absence de catalyseur

(2) : catalyse avec stabilisation de l'état de transition

(3) : catalyse avec remplacement d'une réaction lente par deux réactions plus rapides.

1.3 Expliquer pourquoi la concentration [ES] du complexe enzyme/substrat peut être considérée comme constante au cours de la réaction.
Les réactions de constantes de vitesse k1 et k-1 sont rapides et l'équilibre est rapidement atteint. ES est consommé dans la réaction de constante de vitesse k2. La concentration de l'espèce ES reste faible et peut être considérée comme constante.
1.4 Montrer que les différentes concentrations sont reliées par : [ES] =[E][S] / KM.
On exprimera KM (constante de Michaelis) en fonction de k1, k-1 et k2.
d[ES]/dt = 0 ; k1[E][S]-k-1[ES]-k2[ES]=0.
k1[E][S] = (k-1 +k2)[ES] ; [ES] = k1/ (k-1 +k2) [E][S] ; KM=(k-1 +k2) /k1.
On note [E0] la concentration initiale de l'enzyme et v =d[P] / dt la vitesse de formation de l'acétylcholine P.
1.5 Justifier que la vitesse maximale vmax de formation de P s'écrit : vmax = k2[E0].
v = k2 [ES].
Conservation de la quantité d'enzyme : [E]0=[E] +[ES].
[ES] = [E]0-[E] =[E]0-[ES]KM / [S].
[ES] = [E]0 /(1+KM / [S] ) = [E]0 /([S]+KM )
v = k2 [ES] = k2[E]0 [S] / ([S]+KM ).
vmax correspond à [ES] =[E]0 ; vmax = k2[E0].
1.6 Etablir l'équation de Michaelis donnant la loi de vitesse du mécanisme de catalyse enzymatique
étudié : v = vmax [S] /(KM + [S]).
v =k2[E]0 [S] /([S]+KM ) = vmax[S] /([S]+KM ).
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1.7 Tracer la courbe 1 / v en fonction de 1/ [S]. (représentation graphique de Lineweaver et
Burke). Expliquer comment déterminer KM et vmax.
v = vmax /(KM / [S]+1).
1/v = 1/vmax +KM /(vmax [S]).

Comme dans toute synthèse in vivo, l'action enzymatique peut être perturbée par des molécules
du milieu nommées inhibiteurs. On note I, l'inhibiteur. Au mécanisme précédent, on considère
en plus l'équilibre suivant dû à la présence de I.
E + I = EI de constante d'équilibre : KI =[EI] /([E][I]).
1.8 Justifier l'emploi du terme "inhibiteur". Expliquer pourquoi, dans le cas présent, l'inhibiteur est qualifié de compétitif.
L'enzyme E peut réagir avec le substrat mais aussi avec l'inhibiteur I. Il y a compétition entre les deux réactions. L'inhibiteur diminue l'activité de l'enzyme.
1.9 Citer deux autres sortes d'inhibiteurs. Détailler leurs actions.
Un inhibiteur incompétitif ne se fixe jamais à l'enzyme libre mais seulement à l'enzyme complexée avec le substrat et empèche la formation des produits.
Un inhibiteur non compétitif peut se lier à la fois à l'enzyme libre et à l'enzyme complexée avec le substrat. L'inhibiteur se fixe sur un site de fixation et l'enzyme sur le site actif. Il n'y a pas compétition. L'inhibiteur entraîne la modification de la conformation du site actif, empéchant la transformation du substrat en produit.
1.10 Dans ces conditions, montrer que la loi de vitesse de formation de P prend la forme :
v = vmax[S] / (K'M + [S]).
On exprimera K'M en fonction de KM, KI et [I].

Conservation de la quantité d'enzyme : [E]0=[E] +[ES]+[EI].
Or KI = [EI] / ([ES][I]).
E]0=[E] +[ES]+KI[ES][I].
[ES] (1+KI[I])= [E]0-[E]=[E]0-[ES]KM / [S].
[ES] = [E]0 /(1+KM / [S]+KI[I] ).
v = k2 [ES] =k2 [E]0 /(1+KM / [S]+KI[I] ).
v= vmax[S] /([S]+KM +KI[I] [S]).
K'M = KM +KI[I] [S].
1.11 Dans le cadre du modèle de Lineweaver-Burke, tracer la courbe correspondant au mécanisme en présence d'inhibiteur. Ajouter la courbe correspondant au mécanisme sans inhibiteur. Commenter les courbes obtenues.
Courbe rouge ci-dessus ( sans inhibiteur) ; courbe bleue ( avec inhibiteur compétitif).
Dans ce dernier cas, K'M est plus élevé que KM, l'activité de l'enzyme est plus faible.









Synthèse stéréocontrôlée d'un inhibiteur.
L'acide 2-amino-4-phénylbutyrique (ou homoalanine [1]) inhibe certains enzymes. Afin d'étudier la reconnaissance de cette structure par les molécules-cibles, la synthèse stéréocontrôlée de l'homoalanine et de ses homologues a été entreprise dans le but de tester l'activité biologique

2.1 Les a-amino-acides naturels appartiennent à la série L. Indiquer la signication de cette propriété.
L signifie lévogyre : une molécule (L) est optiquement active et fait tourner le plan de la lumière polarisée vers la gauche.
La synthèse de l'homoalanine commence par la réaction d'un réactif de Grignard, le phénylbromomagnésium, avec l'oxiranne pour donner, après hydrolyse, l'alcool [2].


2.2 Sur la base de l'électronégativité des atomes de carbone et magnésium, indiquer la polarisation de la liaison carbone-magnésium. En déduire la nature (électrophile ou nucléophile) du réactif de Grignard. Proposer un mécanisme pour la formation de [2].
Électronégativité (échelle de Pauling) : (C) = 2, 55 ; (Mg) = 1,31.

Le carbone est plus électronégatif que le magnésium. Le carbone porte une charge partielle négative et le magnésium une charge partielle positive.

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L'alcool [2] est transformé en un composé bromé, lequel est ensuite converti en un nouveau réactif de Grignard [3] (C6H5-CH2-CH2-MgBr) utilisé dans l'étape suivante. Cette étape-clé utilise un composé chiral abondant, le menthol [4] comme inducteur asymétrique.

2.3 Indiquer les centres stéréogènes du menthol et leurs descripteurs stéréochimiques (utiliser la numérotation fournie dans le dessin pour la justication des descripteurs stéréochimiques des centres stéréogènes).
Les atomes de carbone 1(R), 2 (S) et 5(S) sont asymétriques.

2.4 Représenter le conformère chaise du menthol [4] de plus basse énergie.
2.5 Dessiner le conformère chaise du menthol en équilibre avec celui de la question précédente.
Le passage d'une conformation chaise à une autre, inverse les positions axiales et équatoriales.


Dans la conformation la plus stable, les substituants sont en position équatoriale.
Le menthol [4] est traité par le chloroglyoxylate de méthyle [5]. On obtient un diester noté [6] qui réagit avec un équivalent de [3] pour conduire au cétoester [7].

2.6 Donner la structure de [6]. Préciser le mécanisme de la réaction [6] + [3] ! [7].

[6] possède deux sites électrophiles sur lesquels [3] peut réagir mais une seule réaction est observée.
2.7 Expliquer l'origine de cette chimiosélectivité.
Le site le moins encombré réagit avec le composé 3. ( encombrement stérique du cyclohexane substitué ).
La fonction cétone de [7] est réduite par un borohydrure (schématiquement écrit sous la forme H- et, grâce à l'environnement chiral apporté par le groupe menthyle (rôle d'inducteur asymétrique), l'alcool stéréoisomère [8] est obtenu très majoritairement.
2.8 Quel est l'autre stéréoisomère (noté [8']) formé lors de cette réaction ? Les stéréoisomères [8] et [8'] ont-ils des propriétés physiques (solubilité, point d'ébullition. . .) différentes ou identiques ?
Deux énantiomères ont des propriétés chimiques et physiques identiques sauf l'action sur la lumière polarisée.
On place [8] dans le méthanol en présence d'une quantité catalytique d'acide (noté H+) et après réaction, on isole [9].
2.9 Quelle est la nature de la réaction [8] --> [9]. Préciser son mécanisme.
Trans estérification.
Ester 1 + alcool = Ester 2 + autre alcool.
étape 1 : protonation du carbonyle
étape 2 : attaque nucléophile sur le site électrophile.
étape 3 : départ de R1-OH ; étape 4 : déprotonation.

L'alcool [9] est ensuite transformé en amine [11] par activation de l'alcool au moyen d'un triflate [10] (groupe nucléofuge) puis réaction d'une amine sur le triflate intermédiaire [10] .

2.10 Quel est le phénomène observé lors de la transformation [10] --> [11] ? En déduire la loi de vitesse de la réaction en accord avec la stéréochimie.
2.11 Indiquer le mécanisme de la réaction précédente.
On observe une inversion de configuration du centre stéréogène, donc mécanisme du type SN2.
La cinétique est d'ordre 2. Loi de vitesse v = k[10] [RNH2].



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